qPCRBIO SyGreen® Mix は、独自の非阻害インターカレーション色素とポリメラーゼ技術およびバッファー化学の最新の進歩を組み合わせて、高速、高感度、再現性のある色素ベースのリアルタイム qPCR を実現します。

[emanon_toc title=””]

qPCRBIO SyGreen® Mix は、最適化を最小限またはまったく必要とせず、高速、高感度、再現性のある色素ベースのリアルタイム qPCR 用に設計されています。抗体媒介ホット スタート システムにより、プライマー ダイマーや非特異的な生成物の形成が防止され、反応の感度と特異性が大幅に向上します。

PCR Biosytems 社の 2x ミックスでは、他の一般的な蛍光色素とは異なり、PCR を阻害しない独自の DNA インターカレーション色素を使用しています。標準サイクリング条件での qPCRBIO SyGreen® Mix の感度と一貫性を向上させるのと同じ開発により、高速および超高速サイクリング条件でも業界をリードするパフォーマンスを実現しています。

qPCR 選択ツールを使用して、どの ROX 変異体がお使いの機器と互換性があるかを調べることができます。

これらのインターカレーション色素は、約 3.5 ～ 4 ヌクレオチドにわたる二本鎖 DNA の副溝への分子のインターカレーションを可能にする芳香族基と平面基を持っています。存在する正の基は色素を安定化させ、負に帯電した DNA 骨格との調整を可能にします。

このDNAへの結合メカニズムにより、二次構造が形成されない限り、一本鎖核酸に結合することはできません。一方、dsDNAに挿入されると蛍光は最大1,000倍に増加します。

色素が DNA 塩基対の間に挿入されると、結合した色素の量 (したがってサンプル中の DNA の量) に比例して蛍光を発します。これにより、ゲル上またはリアルタイム qPCR 機器の蛍光計で核酸を視覚化できます。後者の場合、サンプル内の挿入された染料分子の数は qPCR の進行とともに増加し、各サイクルでそれに応じて蛍光が増加します。反応の開始時に、遊離染料は基本レベルの蛍光を発します。反応が進むにつれて、蛍光強度は指数関数的に増加し、後のサイクルで横ばいになり、典型的なシグモイド増幅プロットになります。

多用途のターゲット検出
SyGreen または SYBR Green タイプの染料をプライマーと組み合わせることで、研究者は任意のターゲット分子を検出できます。この多用途性により、高スループットのシングルプレックス qPCR をシンプルかつコスト効率よく設計できます。

可逆的な蛍光シグナル蓄積
DNA インターカレーション色素の使用により、蛍光シグナルの可逆的な蓄積が促進されます。強い蛍光はインターカレーション色素からのみ発生するため、DNA の変性により蛍光シグナルが減少します。この特性により、融解曲線分析による特異性テストが可能になり、qPCR 特異性の迅速な評価が可能になります (詳細は以下を参照)。

非特異的シグナルの生成
インターカレーション色素は、反応チューブ内に存在する dsDNA 分子に結合すると、非特異的蛍光シグナルを生成する可能性があります。これは、誤ったプライミング、サンプル内の類似配列の存在、プライマー二量体の形成、またはプライマーヘアピン構造の可能性によって発生する可能性があります。結果を検証するには、融解曲線分析、ゲル電気泳動、またはサンガー配列決定などの追加分析を実行する必要があります。

単一ターゲットアッセイ
染料ベースの qPCR では、反応ごとに 1 つのターゲットのみをアッセイできます。サンプル内の複数のターゲットを定量化するには、対応する数の反応を設定する必要があります。

融解曲線分析は、qPCR 産物の融点を特定し、産物の特異性に関する貴重な洞察を提供するのに役立ちます。この分析には、qPCR サイクリング プログラムの最後に追加の熱サイクリング ステップが含まれます。このステップでは、インキュベーション温度を段階的に増加させながら、各温度間隔 (たとえば、0.1 ～ 0.5 °C ごと) で蛍光データを収集することで、反応サンプルを徐々に変性させます。温度に対して蛍光強度データをプロットすると、融解曲線が生成されます。特定の産物を含む反応では、温度がターゲットの融点に近づくまで蛍光は安定しており、その時点で急速にベースラインまで低下します。蛍光が最大値の 50% に低下する温度が、その分子の融点または Tm と見なされます。反応の特異性の評価は、dRFU/dT として知られる、温度変化 (dT) に対する蛍光強度の一次導関数 (-dRFU) をプロットすることで簡素化できます。特定の単一の生成物との反応の場合、生成物の Tm を中心とする放物線状のピーク（融解ピーク）が生成されます。

染料ベースの qPCR または qPCR 全般に関する詳しい情報については、技術ガイドを参照してください。

免責事項
SYBR Green は Molecular Probes Inc. の登録商標であり、Thermo Fischer Scientific が所有しています。PCR Biosystems Ltd. はこれらの団体とは一切関係ありません。

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したガンマ アクチンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線は上部パネルに、融解曲線は中央パネルに、増幅効率は下部パネルに示されています。上部パネルで特定された競合製品 (灰色の曲線) との直接的なオンプレート比較が実行されました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈が、総反応容量 10 µL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、すべての競合製品と比較して、Ct が早く、融解ピークがきれいで、効率が優れています。

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したベータ アクチンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線は上部パネルに、融解曲線は中央パネルに、増幅効率は下部パネルに示されています。上部パネルで特定された競合製品 (灰色の曲線) との直接的なオンプレート比較が実行されました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈が、総反応容量 10 µL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。qPCRBIO SyGreen® Mix は、すべての競合製品と比較して、Ct が早く、融解ピークがきれいで、効率が優れています。

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用したベータ 2 ミクログロブリンの増幅 (紫色の曲線)。増幅曲線はセット a とセット b の上部パネルに示され、融解曲線は中央のパネルに示され、増幅の効率は下部パネルに示されます。

各セットの上部パネル（灰色の曲線）で特定された競合製品と、プレート上で直接比較を行いました。マウス cDNA テンプレートの 5 段階希釈液が、総反応量 10 μL で使用されました。サイクリング条件は、各競合製品が推奨する条件でした。

qPCRBIO SyGreen® Mix は、競合他社の各ミックスと比較して、Ct が早く、融解ピークがより鮮明で、効率が優れています。

qPCRBIO SyGreen® Mix Lo-ROX

qPCRBIO SyGreen® Mix High-ROX

qPCRBIO SyGreen® Mix with Fluorescein

qPCRBIO SyGreen® Mix Separate-ROX

サーマルサイクリングプログラムにおいて、95℃での最初のポリメラーゼ活性化ステップの時間を短縮できますか？

はい、qPCRBIO SyGreen® (Blue) Mix の 95 °C での活性化時間は 10 秒まで短縮できます。ほとんどのテンプレートの増幅には影響しません。ただし、特に難しい高 GC ターゲットを扱う場合は、マニュアルで推奨されている 2 ～ 3 分の活性化とテストして比較することをお勧めします。

qPCRBIO SyGreen® Mix で生成された生成物は、消化、クローン化、およびシーケンスできますか？

はい、qPCRBIO SyGreen® Mix で生成された PCR 産物は、野生型 Taq ポリメラーゼで生成された PCR 産物と同じ特性を持っています。標準プロトコルを使用して、制限エンドヌクレアーゼで配列決定または消化することができます。産物は 3′-d(A) 末端で、TA クローニングに使用できます。また、クローニング前に平滑末端にしたり、制限酵素で消化したりすることもできます。最良の結果を得るには、標準的な PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 産物を精製することをお勧めします。

ROX は反応に悪影響を及ぼす可能性がありますか？

ROX (6-carboxy-X-rhodamine) は、主にウェル間の光路のばらつきによって生じる蛍光レベルの変動を正規化するために、ROX 依存型リアルタイム PCR 機器でパッシブ リファレンス 色素として使用されます。蛍光強度 (Rn) の正規化は、リアルタイム PCR ソフトウェアで、特定の信号の発光強度を ROX の発光強度で割ることによって行われます。

ROX は PCR 反応には関与せず、その蛍光レベルは各ウェルの DNA の量に比例しないため、この蛍光体を混合物に追加すると、増幅中に一定の蛍光信号が得られます。

パッシブ リファレンス スタンダードを必要とするさまざまなタイプのリアルタイム PCR 機器では、主に各システムの光学構成 (つまり、使用される励起源と光学系の種類) が異なるため、ROX の最適濃度が異なります。

ROX の添加量が少なすぎたり多すぎたりすると、非常にノイズの多い信号になり反応の結果に影響を及ぼすため、お客様にとって次のことが非常に重要です:

1. リアルタイム PCR の結果を最適化するために適切な ROX 濃度を決定する
2. 反応を設定するために使用するソフトウェアで ROX 設定を確認する

最も一般的に使用されるシステム用の便利な選択ツールは、こちらにあります。

qPCRBIO SyGreen® Mixes は、重硫酸塩に変換された gDNA テンプレートで機能しますか？

はい。重硫酸塩に変換した gDNA に qPCRBIO SyGreen® Mix をうまく使用したと報告したお客様がいます。

サンプル DNA を 1x TE (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA) バッファーに保存すると、qPCRBIO SyGreen® Mix を使用した後続の qPCR と互換性がありますか？

はい、この保存バッファーは互換性があります。EDTA は混合物中のマグネシウムの一部をキレート化しますが、反応に大きく影響するほどではありません。

qPCRBIO SyGreen® Mixes には SyGreen®色素が含まれています。これは SYBR green ファミリーに属しますか？

SyGreen® は、SYBR™ Green と同じ非対称シアニン色素ファミリーに属しています。SyGreen® はこのファミリーの改良された新世代色素です。SYBR™ Green と同様に、SyGreen® は DNA に挿入されます。SYBR™ Green とは異なり、SyGreen® は広範囲の色素濃度で PCR 増幅をサポートします。つまり、色素は PCR 反応を阻害しません。これは、ヌクレオチド組成に偏りがないため、原核生物と真核生物のテンプレートの両方で堅牢で一貫性のある DNA 融解曲線を生成するのに役立ちます。

qPCRBIO SyGreen ミックスの ROX 濃度はどれくらいですか？

パッシブリファレンス色素を含む qPCRBIO SyGreen® Mix は、異なる配合で提供され、それぞれ異なる濃度のパッシブリファレンス色素を含みます。

• qPCRBIO SyGreen Mix Lo-ROX には 112 nM ROX が含まれています。
• qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX には 1.12 µM ROX が含まれています。
• qPCRBIO SyGreen Mix Fluorescein には 0.2 mM のフルオレセインが含まれています。
• qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX 2x ミックスには ROX が含まれておらず、50 µM ROX 添加剤の別のチューブが含まれています。これにより、使用する ROX の濃度を選択できます。

qPCR 選択ツールを使用して、どのミックスが qPCR マシンに最適かを確認できます。

SyGreen® を含むミックスの検出にはどのチャネルが適していますか？

SyGreen® は FAM/SYBR チャネルで検出されるはずです。

ご使用の機器が 2 つの色素の分離を可能にしている場合は、SYBR チャネルが推奨される場合があります。

qPCRBIO SyGreen® Mix には何が含まれていますか？

qPCRBIO SyGreen® Mix は、すぐに使用できる qPCR 2x マスターミックスです。反応のセットアップ時にプライマー、テンプレート DNA、PCR グレードの水を追加するだけです。

ROX とは何ですか？ それは必要ですか？

ROX はパッシブリファレンス色素であり、PCR 反応には関与しません。PCR に関連しない蛍光の変動を標準化するために使用されます。「リソース」セクションの qPCR 選択ツールを使用して、どの qPCR ミックスがお使いの qPCR マシンに最適かを判断できます。

qPCRBIO SyGreen® Mixes で使用される HS Taq DNA ポリメラーゼのエラー率はどれくらいですか？

この酵素のエラー率は、取り込まれたヌクレオチド 2.0 x 10⁵ あたり約 1 個のエラーです。

qPCRBIO SyGreen® Mixes の MgCl₂ 濃度はどれくらいですか？

すべての 4x qPCRBIO SyGreen® Mixes には、6 mM の濃度で MgCl₂ が含まれています。つまり、反応の最終濃度は 3 mM です。

ROX によるシグナルの正規化が競合他社のミックスと比較して低いと思われる場合は、何を考慮する必要がありますか？

異なる機器には異なる ROX 濃度が必要なため、正しい濃度の ROX を使用していることを確認してください。たとえば、Lo-ROX ミックスを必要とする機器で qPCRBIO SyGreen® Mix Hi-ROX を使用すると、ソフトウェアは qPCRBIO シグナルを Hi-ROX レベルに対して正規化します。この場合、競合他社に Lo-ROX ミックスが選択されていたとすると、競合他社のミックスに比べて qPCRBIO ミックスの蛍光レベルが大幅に低下します。

異なるメーカーのミックスを比較する場合は、データを分析する前に、別々に実行するか、パッシブ リファレンスをオフにすることをお勧めします。

標準希釈により増幅効率が低下した場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

標準曲線の希釈度が上がると効率が低下することが報告されています。これを回避するには、標準を 10 mM Tris-HCl pH 8.0、0.1 mM EDTA、0.05% Tween-20 で希釈することをお勧めします。EDTA はキレート剤で、DNAse 活性を防ぐ役割を果たします[1]。Tween-20 は界面活性剤であり、DNA がチューブの側面に吸着するのを防ぎます[2]。ほとんどのマイクロ遠心分離機はポリプロピレン製で、DNA はポリプロピレンに非常によく付着することが研究で実証されています[3]。

標準物質は希釈後に凍結しないでください。界面活性剤の存在下であっても、凍結により DNA がポリプロピレンに不可逆的に結合するようです。標準物質を 4°C で保存し、数週間ごとに新しいバッチを準備することをお勧めします。

1. Barra, G. B. et al. EDTA-mediated inhibition of DNases protects circulating cell-free DNA from ex vivo degradation in blood samples. Clin Biochem 48, 976-981, doi:10.1016/j.clinbiochem.2015.02.014 (2015).
2. Linnarsson, S. Recent advances in DNA sequencing methods – general principles of sample preparation. Exp Cell Res 316, 1339-1343, doi:10.1016/j.yexcr.2010.02.036 (2010).
3. Gaillard, C. & Strauss, F. Avoiding adsorption of DNA to polypropylene tubes and denaturation of short DNA fragments. Technical Tips Online 3, 3 (1998).

バックグラウンドシグナルが非常に高い場合、どのようなトラブルシューティングが推奨されますか？

蛍光のバックグラウンド レベルが高い場合、反応中のテンプレートが多すぎることが原因である可能性が高くなります。これは、テンプレート DNA に結合する SyGreen® 色素を検出する qPCR 機器に関連しています。サンプルには通常、ターゲット遺伝子以外の DNA が多く含まれているため、蛍光を検出するのに十分な量があります。この問題を解決するには、サンプルを 100 倍から 1000 倍に希釈することをお勧めします。

これにより、バックグラウンド信号が減少するだけでなく、希釈によって Ct 値が標準で得られた値の範囲内になるため、正確な定量が可能になります。Ct が最初の標準よりも早い場合、公表できるほど正確な定量とは見なされないことに注意してください。

競合他社の製品と同じプライマーと PCR 条件を使用した場合に、非特異的な生成物が発生するのはなぜですか？

おそらく、最初のステップ (ホット スタート) の時間が短すぎることが原因です。酵素を完全に活性化するには、ホット スタート段階を 95°C で 2 分間行うようにしてください。推奨される温度プロファイルは次のとおりです。

• 95°C (120 seconds)
• 40 cycles: 95°C (5-15 seconds) – 60°C (20-30 seconds)
• Melt

それでも非特異的な生成物が得られる場合、使用するプライマー セットに応じて、アニーリング/伸長温度を 60°C から 65°C に上げることをお勧めします。

qPCRBIO SyGreen® Mix を使用すると、競合他社の製品と比較して Ct が早いのはなぜですか？

CT が早いということは、2 つのことのいずれかを示している可能性があります。1 つ目は、競合他社の製品に比べて当社製品のパフォーマンスが非常に優れていることの結果である可能性があります。PCR Biosystems 社は競合他社よりも高速になるように製品を設計しており、多くの製品よりも大幅に高速であることがわかりました。

2 つ目は、非特異的な生成物によって引き起こされる可能性があります。これは、qPCR 実行の最後に融解分析を実行することで確認できます。結果に 1 つのピークが表示された場合は、正しい産物が増幅された可能性があります。競合他社のミックスと比較して、PCR Biosystems 社のミックスではピークの位置が異なることがありますが、塩濃度と pH が融解温度に影響を与えるため、これは正常です。結果に複数のピークが表示された場合は、反応が特異的ではありません。PCR 産物をアガロース ゲルで実行して、バンドが 1 つだけであるかどうか、および競合他社の製品で得られたアンプリコンと同じサイズであるかどうかを確認することもできます。

非特異的な生成物の問題に対処するには、サーマルサイクルを調整する必要があります。